Variación estacional del contenido proteico y actividad de la PLA₂ del veneno de Crotalus molossus molossus entre especímenes de origen silvestre y en cautiverio

RESUMEN

Los envenenamientos por mordeduras de serpientes de cascabel son de importancia médica. Los diversos factores que la medicina atiende son el clima, la edad, el sexo, la distribución, la época del año y el régimen alimenticio, ya que éstos hacen que las serpientes sean más venenosas y tóxicas. El objetivo del presente trabajo es proporcionar información acerca de la variación estacional del contenido proteico y el daño hemolítico producido por el veneno de Crotalus molossus molossus en cautiverio y en vida silvestre. Para ello, se analizaron 16 muestras de veneno por medio de un método colorimétrico y visualizadas por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE por sus siglas en inglés). La actividad hemolítica de la fosfolipasa A₂ (PLA₂) fue evaluada en placas de agar-eritrocitos. Se observó una gran variación en el contenido proteico de los venenos de las serpientes en cautiverio y en vida silvestre, donde sobresale la pool de invierno de vida silvestre, la cual presentó una mayor concentración de 697 µg/µl ± 5.9 µg/µl, seguido por el pool de otoño en cautiverio (648 µg/µl) ± 20.8 µg/µl), el pool de primavera en cautiverio (528.51 µg/µl ± 10.59 µg/µl) y el pool de verano en cautiverio con 387.9 µg/µl ± 5.6 µg/µl. Se purificó la PLA₂ del veneno observándose en las fracciones independientes 27, 39, 26 y 27 (n=60) de primavera, verano, otoño e invierno, respectivamente. La muestra de otoño presentó mayor actividad hemolítica y la de invierno la de menor actividad. Finalmente, las muestras de veneno de las serpientes mantenidas en cautiverio presentaron mayor concentración en comparación con las de vida silvestre, así como también se observaron variaciones con la actividad hemolítica de acuerdo con la época del año.

Uno de los objetos de interés en el área de la salud pública son los envenenamientos generados por la mordedura de las serpientes de cascabel (Rael, Rivas, Chen, Maddux, Huizar & Lieb, 1997). Los diversos factores como el clima, la edad, el sexo, la distribución, las estaciones del año y el régimen alimenticio de las serpientes hacen que éstas sean más venenosas y tóxicas (Forstner, Hilsenbeck & Scudday, 1997; Gómez, 2000). Se ha observado que de acuerdo con el tipo de hábitat que presenten las serpientes y de la misma especie, el veneno se comporta de diferente manera (French, Hayes, Bush, Cardwell, Bader & Rael, 2004). Crotalus molossus molossus es la serpiente de cascabel conocida comúnmente como víbora de cascabel de cola negra (Campbell & Lamar, 2004; Lemos-Espinal & Smith, 2007). Esta serpiente es menos venenosa que otras de su género, pero sí llega a presentar un daño grave a los seres humanos provocando lesiones, que van desde hemorragias, necrosis en el área de la mordida, pérdida de la extremidad afectada hasta la muerte (Sánchez, Solís, Ramírez & Pérez, 2001). El veneno de esta serpiente, constituido por enzimas, proteínas y toxinas, actúa sobre la sangre destruyendo los glóbulos rojos y el tejido muscular, y como daño secundario actuando sobre el sistema nervioso (Gómez, 2000). De acuerdo con diversos estudios de variación del contenido proteico en venenos de serpientes, se ha observado que se presentan variaciones de concentración, teniendo serpientes en cautiverio y modulando la temperatura, simulando las diferentes estaciones; además, se ha observado que existen diferencias entre concentración de proteína (Gregory-Dwyer, Egen, Bosisio, Righetti & Russell, 1986). López-Lozano et al. (2002) compararon el veneno de ejemplares juveniles, semiadultos y adultos de Bothrops atrox, que fueron colectados en la región de Manaus en Brasil, observando que el veneno de los juveniles y semiadultos presentaron una mayor actividad anticoagulante que los adultos. Galán, Sánchez, Rodríguez-Acosta & Pérez (2004) neutralizaron el veneno de la serpiente Crotalus helleri de dos localidades diferentes, una del sureste de California, Estados Unidos (EUA), y otra del norte de Baja California, México, las cuales presentaron diferencias en el veneno, tanto en la concentración proteica como en el color. Por otra parte, se ha analizado la actividad enzimática y hemolítica que producen los venenos de los vipéridos, especialmente con la fosfolipasa A₂ (PLA₂), miotoxicidad, neurotoxicidad y la letalidad del veneno (Bonilla & Zavaleta, 1997). Así, el propósito fundamental de esta investigación es la de proporcionar información acerca de la variación estacional del contenido proteico y el daño hemolítico del veneno total de la serpiente Crotalus molossus molossus durante las cuatro estaciones del año, tanto en cautiverio como en vida silvestre, para poder predecir la peligrosidad y toxicidad de su veneno. Ello debido a que existe poca información sobre el efecto hemolítico que causa el veneno de las serpientes en la región norte del país, infiriendo que haya una relación con el contenido proteico y las estaciones del año.

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestreo y colecta de veneno

Se realizó un estudio entre el otoño de 2006 hasta finalizar el invierno a principios del 2008, realizando un total de 11 salidas (dos en primavera, tres en verano, tres en otoño y tres en invierno), de las cuales se colectaron siete serpientes silvestres y dos serpientes en cautiverio, obteniendo un total de 16 muestras de veneno. Dichos muestreos se realizaron en cuatro localidades del estado de Chihuahua, México (figura 1). El veneno se extrajo con la ayuda de un gancho herpetológico; se tomó la cabeza sujetando el cuello e induciendo la mordedura sobre un vaso de precipitado de 200 ml tapado con papel Parafilm® en el Laboratorio de Ecología y Biodiversidad Animal (LEBA) de la Universidad Autónoma de Ciudad Juárez (UACJ). Una vez colectado el veneno, se colocó en un microtubo de plástico de 1.5 ml cerrado herméticamente, y se mantuvo almacenado a -20 ˚C en el Laboratorio de Biología Molecular y Bioquímica (LBMB) de la UACJ. El veneno colectado por espécimen fue manejado como volumen total (pool), y se tomó en consideración su futura dilución para evitar perder los datos de actividad bioquímica del veneno por estación del año. Esto fue debido a la limitada colecta de ejemplares por estación del año. El color del veneno se caracterizó por la turbidez que presentó y la presencia de la proteína L aminoácido oxidasa (LAO) (Galán et al., 2004). Debido a cuestiones de seguridad, los ejemplares fueron manipulados en el LEBA. La preservación de las muestras y el análisis bioquímico se realizaron en el LBMB.

Figura 1. Localización de los sitios de colectas en el estado de Chihuahua, México (situado en las coordenadas 28° 30' de latitud norte y de 10° 00' de longitud oeste, colindando con el estado de Texas (EUA). Donde: (a) Sierra Juárez con coordenadas de 31˚ 44’ de latitud norte y 106˚ 29’ longitud oeste; (b) Sierra La Candelaria a 31˚ 02’ latitud norte y 106˚ 25’ longitud oeste; (c) Sierra Peñascos a 31˚ 00’ latitud norte y 106˚ 30’ latitud oeste; y (d) Sierra La Escondida a 30˚ 35’ de latitud norte y 107˚ 40’ de longitud oeste. En el mapa de la República mexicana se señala la región donde se encuentra el estado de Chihuahua. Fuente: www.mapresources.com

Figura 1. Localización de los sitios de colectas en el estado de Chihuahua, México (situado en las coordenadas 28° 30' de latitud norte y de 10° 00' de longitud oeste, colindando con el estado de Texas (EUA). Donde: (a) Sierra Juárez con coordenadas de 31˚ 44’ de latitud norte y 106˚ 29’ longitud oeste; (b) Sierra La Candelaria a 31˚ 02’ latitud norte y 106˚ 25’ longitud oeste; (c) Sierra Peñascos a 31˚ 00’ latitud norte y 106˚ 30’ latitud oeste; y (d) Sierra La Escondida a 30˚ 35’ de latitud norte y 107˚ 40’ de longitud oeste. En el mapa de la República mexicana se señala la región donde se encuentra el estado de Chihuahua. Fuente: www.mapresources.com                                                                                                                                                                    Close

Análisis del contenido proteico

El contenido proteico de 16 muestras conformando siete pool de veneno de Crotalus molossus molossus (tabla 1) se determinó por el método de Lowry, Rosebrough, Farr & Randall (1951), usando albúmina sérica bovina (BSA) como curva patrón.

Visualización del contenido proteico

Se analizaron un total de 16 muestras de veneno que fueron sometidas de manera individual a electroforesis desnaturalizante en placa según el método de Laemmli (1970). Para ello se utilizaron geles de poliacrilamida al 10% o 15% (p/v) formados en presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS por sus siglas en inglés) y un sistema Mini-Protean III de Bio-Rad (Estados Unidos). La electroforesis se realizó a voltaje constante de 120 V por espacio de 90 min y a temperatura ambiente, usando como marcadores de masa molecular miosina (215 kDa), fosforilasa b (120 kDa), albúmina de suero bovino (84 kDa), albúmina de huevo (60 kDa), anhidrasa carbónica (39.2 kDa), inhibidor de tripsina (28 kDa) y lisozima (18.3 kDa).

Fraccionamiento del veneno

El veneno fue eluido (1:10) en solución amortiguadora de fosfato de potasio dibásico, y fue aplicado a una columna de 90 cm ´ 1.8 cm de gel Sephadex G-75 (Sigma) superfino, calibrado a temperatura ambiente con amortiguador de fosfato de potasio dibásico (F.W. 174.18, pH 8.4, al 98%), manejando a flujo constante de 22.22 ml/h. Las fracciones eluidas (1.5 ml/tubo) fueron colectadas manualmente en tubos individuales y fueron cuantificadas espectrofotométricamente a una absorbancia de 280 nm, de acuerdo con Bonilla & Zavaleta (1997).

Determinación de la masa molecular aparente

La masa molecular aparente de las fracciones fue estimada mediante filtración en gel Sephadex G-75 (Sigma) y electroforesis vertical en gel de poliacrilamida. Para la electroforesis las fracciones de interés fueron analizadas en gel de poliacrilamida al 15% en las condiciones descritas anteriormente.

Actividad hemolítica

La actividad hemolítica fue ensayada bajo el método descrito por Bonilla & Zavaleta (1997) en eritrocitos humanos obtenidos de donadores Rh A positivos, los cuales fueron mantenidos en suspensión con amortiguador glicina-NaCl (glicina 0.1 M en cloruro de sodio al 0.6%) a pH 5.8. La actividad hemolítica fue evaluada por el método siguiente:

• Hemolisis en placa de agar

Unidades de hemolisis directa en placa (UHD). Se realizó una mezcla en partes iguales de agar (invitrogen UltraPureTM) de alta electroendosmosis al 1% (p/v) y agar (invitrogen UltraPureTM) de baja electroendosomosis al 1% (p/v) con amortiguador acetato de sodio 0.05 M a pH 7.5 calentada a 40 °C para disolver el agar. Posteriormente se dejó enfriar la mezcla y se adicionaron 2 ml de eritrocitos previamente lavados en solución Gly 0.1 M/NaCl 0.6% (p/v). La mezcla fue vertida en placas de Petri. Luego de la polimerización se realizaron orificios de 1.5 mm de diámetro en el gel para adicionar 5 µl de veneno, adicionando la misma cantidad de solución salina como control. Las muestras fueron incubadas a 37 °C, por periodos variables de tiempo (0 min-120 min), midiéndose posteriormente el diámetro (mm) del halo producido con un Vernier. Se calcula con la siguiente fórmula:

Actividad de fosfolipasa

Se midió por medio de análisis de placa bajo el protocolo descrito por Habermann & Hardt (1972) y citado por Bonilla & Zavaleta (1997), que mide la formación de un halo claro producto de la hidrólisis de la lecitina por la fosfolipasa. Se preparó una placa de agar yema de huevo (85%) para realizar la actividad de la fosfolipasa, en donde una unidad de actividad fosfolipásica (UF) en placa se expresa como la cantidad de proteína capaz de lisar 1 mm de gel en 1 h de incubación. Se determinó mediante la fórmula:

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó por medio del programa Minitab 15, usando la prueba no paramétrica Mann Whitney para determinar las diferencias estadísticas a un IC₉₅. Las gráficas fueron obtenidas por el programa SigmaPlot® V. 11.

RESULTADOS

Caracterización visual del veneno

Se obtuvieron un total de 16 muestras de veneno correspondientes a nueve serpientes de cascabel en el periodo señalado, en metodología de estudio correspondiendo a siete pool de veneno, obteniendo diferentes concentraciones y volúmenes de veneno (tabla 1). El promedio del volumen total del veneno extraído fue de 404.28 μl. El 14.28% de las muestras presentaron un patrón de coloración amarillo claro (+), el color amarillo leve (++) y el amarillo intenso (+++), con un 42.85% cada uno.

Tabla 1. Índices de ajuste de la estructura del compromiso organizacional.
pool por estación y condición	n	Concentración de color	Cantidad µl
Primavera vida silvestre	1	++	700
Primavera cautiverio	3	++	530
Verano cautiverio	2	+	95
Otoño vida silvestre	4	++	490
Otoño cautiverio	2	+++	140
Invierno vida silvestre	1	+++	450
Invierno cautiverio	4	+++	425

Fuente: Elaboración propia.                                                                                                                                Abrir

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Concentración proteica de veneno en las estaciones del año

Se observó la variación proteica de los venenos de las diferentes serpientes en las estaciones del año, bajo las condiciones de cautiverio y vida silvestre, siendo el pool de invierno en vida silvestre el que presentó mayor concentración (697 µg/µl ± 5.7 µg/µl), seguido por el pool de otoño en cautiverio (648 µg/µl ± 20.8 µg/µl), el pool de primavera en cautiverio (528.51 µg/µl ± 10.59 µg/µl) y el pool de verano en cautiverio con 387.9 µg/µl ± 5.6 µg/µl. Se puede observar una diferencia entre las concentraciones proteicas entre los pool de las diferentes estaciones del año, aunque no son significativamente diferentes de acuerdo con la prueba no paramétrica de Mann Whitney, dando un valor de p > 0.05 a un Índice de Confianza (IC) 95% (figura 2).

Figura 2. Variación de la concentración proteica de los pool de los venenos en las diferentes estaciones del año. Fuente: Elaboración propia.

Figura 2. Variación de la concentración proteica de los pool de los venenos en las diferentes estaciones del año. Fuente: Elaboración propia.                                                                                                                                                                     Close

Visualización del contenido proteico en electroforesis SDS-PAGE

En los carriles se depositó una cantidad estándar de 80 μg de proteína (figura 3a), obteniendo una variabilidad de bandas de proteínas en las diferentes épocas del año, donde se puede observar que las serpientes que se encuentran en cautiverio presentan patrones de bandas más densos cuando se comparan con las de vida silvestre, excepto la obtenida en invierno en vida silvestre, la cual presentó mayor densidad de bandas comparada con las de cautiverio (figura 3b).

a)
b)
Figura 3. a) Visualización de todos los venenos de manera individual por medio de SDS-PAGE, donde se puede observar los diferentes tipos de bandas proteicas, donde sobresalen dos bandas principales de 72 kDa y de 29 kDa, un patrón de marcaje que se repite en las muestras de todas las épocas del año. Sobresalen también las muestras de cautiverio en las épocas de primavera, verano y otoño. En invierno, la muestra de vida silvestre se observó con mayor patrón de densidad la banda de 29 kDa en comparación con las de cautiverio. b) Densitometría de las muestras del veneno de la serpiente C. molossus molossus donde se observa que la proteína de 72 kDa presenta una mayor densidad en la época de primavera (P) y la de 29 kDa resalta en un pico con menor densidad. En verano (V) estas proteínas se encuentran en una menor densidad, y sobresaliendo el pico más alto en la de 29 kDa. En otoño (O) se encuentra con mayor densidad la proteína de 29 kDa, y sobresale un pico en una de menor densidad de masa molecular. En invierno (I) la proteína de 72 kDa se presenta disminuida en comparación con las otras estaciones del año, en cambio la de 29 kDa se presenta con mayor densidad. Fuente: Elaboración propia.

Figura 3. Variación de la concentración proteica de los pool de los venenos en las diferentes estaciones del año. Fuente: Elaboración propia.                                                                                                                                                                     Close

Figura 3. Variación de la concentración proteica de los pool de los venenos en las diferentes estaciones del año. Fuente: Elaboración propia.                                                                                                                                                                     Close

Fraccionamiento del veneno

Se colectaron 60 fracciones individuales de la columna de Sephadex G-75, obteniendo distintos valores de absorbancia en cada fracción correspondiente a cada estación del año. Se observó que los picos de mayor concentración están de la fracción 12 a la 31 sin importar la época estacional (figura 4).

Figura 4. Cromatograma de las absorbacias (Abs) a 280 nm del contenido proteico del veneno de C. molossus molossus por estaciones del año con una cantidad de veneno diluido (1:10). Las líneas horizontales hacen más fácil la observación de los picos más altos y, por tanto, la identificación del nivel más alto en la estación de otoño. Fuente: Elaboración propia.

Figura 4. Cromatograma de las absorbacias (Abs) a 280 nm del contenido proteico del veneno de C. molossus molossus por estaciones del año con una cantidad de veneno diluido (1:10). Las líneas horizontales hacen más fácil la observación de los picos más altos y, por tanto, la identificación del nivel más alto en la estación de otoño. Fuente: Elaboración propia.                                                                                                                                                                    Close

Vizualización de la masa molecular aparente

En la figura 5 se pueden observar las fracciones purificadas donde en el carril 1 se depositó la muestra de veneno crudo: carril 6 y 7, la visualización de la PLA₂ en fracciones 24 y 26, respectivamente, y carril 10, marcador de masa molecular.

Figura 5. Visualización de las fracciones de otoño obtenidas por cromatografía en gel de Sephadex G-75 en SDS-PAGE al 15% (p/v). Fuente: Elaboración propia.

Figura 5. Visualización de las fracciones de otoño obtenidas por cromatografía en gel de Sephadex G-75 en SDS-PAGE al 15% (p/v). Fuente: Elaboración propia.                                                                                                                                                                    Close

La observación de la PLA₂ de la muestra de primavera (a) se visualizó en el carril 1 y 3, correspondiente a las fracciones 29 y 27. En los carriles 2 y 4 presentaron bandas, pero no se logró identificar la presencia de la PLA₂. En verano (b) en el carril 8 se identificó la PLA₂ fracción 39. Para invierno (c) se observó la PLA₂ en el carril 10 correspondiente a la fracción 27 (figura 6).

Figura 6. Visualización aparente de la PLA2 por medio de SDS-PAGE al 15% (p/v). Fuente: Elaboración propia.

Figura 6. Visualización aparente de la PLA2 por medio de SDS-PAGE al 15% (p/v). Fuente: Elaboración propia.                                                                                                                                                                    Close

Hemolisis por el veneno crudo en placa de agar

Se realizaron placas de agar-eritrocitos de humano perteneciente a cada estación del año (figura 7). La actividad hemolítica del veneno crudo de Crotalus molossus molossus se evaluó a las 2 h, donde se observó una variación en el diámetro del halo hemolítico, con una cantidad uniforme en volumen de 5 µl para cada estación del año. Para la muestra de primavera se observó un halo hemolítico de 9 mm con una unidad de hemolisis directa (UHD) de 1.88 (panel a); la muestra de verano presentó un halo hemolítico de 7 mm y UHD de 1.69 (panel b); en otoño se observó un halo de 8 mm y una UHD de 1.43 (panel c) y en invierno un halo hemolítico de 6 mm con una UHD de 1.54 (panel d), respectivamente.

a)		b)
c)		d)
Figura 7. Análisis del grado de hemolisis por la PLA2 del veneno crudo en geles de agar-eritrocitos de humano. Paneles: a) primavera 9 mm de diámetro; b) verano 7 mm de diámetro; c) otoño 8 mm de diámetro; d) invierno 6 mm de diámetro. El control negativo presentó un diámetro de 0 mm, debido a que se utilizó una solución de PBS 1X (Na2HPO4 4.3 mM, NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM y KH2PO4 1.4 mM a un pH de 7.4 en agua desionizada). Fuente: Elaboración propia.

Figura 7. Análisis del grado de hemolisis por la PLA2 del veneno crudo en geles de agar-eritrocitos de humano. Paneles: a) primavera 9 mm de diámetro; b) verano 7 mm de diámetro; c) otoño 8 mm de diámetro; d) invierno 6 mm de diámetro. El control negativo presentó un diámetro de 0 mm, debido a que se utilizó una solución de PBS 1X (Na2HPO4 4.3 mM, NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM y KH2PO4 1.4 mM a un pH de 7.4 en agua desionizada). Fuente: Elaboración propia.                                                                                                                                                                    Close

Figura 7. Análisis del grado de hemolisis por la PLA2 del veneno crudo en geles de agar-eritrocitos de humano. Paneles: a) primavera 9 mm de diámetro; b) verano 7 mm de diámetro; c) otoño 8 mm de diámetro; d) invierno 6 mm de diámetro. El control negativo presentó un diámetro de 0 mm, debido a que se utilizó una solución de PBS 1X (Na2HPO4 4.3 mM, NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM y KH2PO4 1.4 mM a un pH de 7.4 en agua desionizada). Fuente: Elaboración propia.                                                                                                                                                                    Close

Figura 7. Análisis del grado de hemolisis por la PLA2 del veneno crudo en geles de agar-eritrocitos de humano. Paneles: a) primavera 9 mm de diámetro; b) verano 7 mm de diámetro; c) otoño 8 mm de diámetro; d) invierno 6 mm de diámetro. El control negativo presentó un diámetro de 0 mm, debido a que se utilizó una solución de PBS 1X (Na2HPO4 4.3 mM, NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM y KH2PO4 1.4 mM a un pH de 7.4 en agua desionizada). Fuente: Elaboración propia.                                                                                                                                                                    Close

Figura 7. Análisis del grado de hemolisis por la PLA2 del veneno crudo en geles de agar-eritrocitos de humano. Paneles: a) primavera 9 mm de diámetro; b) verano 7 mm de diámetro; c) otoño 8 mm de diámetro; d) invierno 6 mm de diámetro. El control negativo presentó un diámetro de 0 mm, debido a que se utilizó una solución de PBS 1X (Na2HPO4 4.3 mM, NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM y KH2PO4 1.4 mM a un pH de 7.4 en agua desionizada). Fuente: Elaboración propia.                                                                                                                                                                    Close

Actividad de PLA₂ del veneno fraccionado

En la muestra de primavera se observó un halo hidrolítico de 9 mm con una unidad de fosfolipasa (UF) de 3.76; para verano se observó una hidrólisis de 7 mm con 3.38 UF; para otoño aumentó a 8 mm la hidrólisis y presentó una UF de 2.87; y para invierno disminuyó, siendo la actividad más baja con 6 mm de diámetro con una UF de 3.07 (figura 8).

Figura 8. Análisis de la actividad de PLA2 pura en placa de agar-yema de huevo y determinación de los halos de hidrólisis durante las diferentes épocas del año. Paneles: a) primavera, b) verano, c) otoño y d) invierno. Fuente: Elaboración propia.

Figura 8. Análisis de la actividad de PLA2 pura en placa de agar-yema de huevo y determinación de los halos de hidrólisis durante las diferentes épocas del año. Paneles: a) primavera, b) verano, c) otoño y d) invierno. Fuente: Elaboración propia.                                                                                                                                                                    Close

AGRADECIMIENTOS

Al Departamento de Ciencias Químico-Biológicas de la Universidad Autónoma de Ciudad Juarez. Proyecto interno registrado como SF-CGIP 2009. Permiso de colecta ante la DGVS/Semarnat y Conabio Proyecto GT032. Se agradece a Nora Reyes Villegas por la elaboración del mapa.