La leptospirosis es un problema de salud pública tanto en países subdesarrollados como en países desarrollados. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS) (WHO, por sus siglas en inglés) cada año se presentan 14 nuevos casos por cada 100 000 habitantes de leptospirosis en el mundo (WHO, 2011). Sin embargo, se cree que la prevalencia de la enfermedad está subestimada (Hartskeerl, 2006). La incidencia promedio mundial de leptospirosis humana endémica es de 5 casos por cada 100 000 habitantes según la OMS, aclarando que existen zonas donde se alcanzaron hasta 975 casos por cada 100 000 habitantes. Para el caso de América la estimación es de 12.5 casos por cada 100 000 habitantes (WHO, 2011). La situación epidemiológica de leptospirosis en México en el 2010 presentaba una tasa nacional de 0.45 casos por cada 100 000 habitantes, y los estados que presentaron una incidencia mayor son: Hidalgo, Sinaloa, Veracruz, Tabasco, Yucatán y Sonora que oscilaban entre 0.22 a 9.80 casos por cada 100 000 habitantes (Secretaría de Salud, 2012). Según los informes periódicos de la Secretaría de Salud (2017), el estado de Sonora presenta anualmente casos confirmados de enfermedades infecciosas como Dengue y Rickettsiosis, ambas con características clínicas muy similares a las que presenta la leptospirosis (García-Ruíz et al., 2016; Levett, 2001). Por tal motivo, a muchos de los pacientes que presentan síndrome febril se les realiza la prueba diagnóstica para estas tres enfermedades.

Existen varias pruebas de laboratorio que se utilizan para el diagnóstico de leptospirosis dentro de las que destacan: cultivo bacteriano, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA), detección de IgM y por la Técnica de Microaglutinación (MAT, por sus siglas en inglés). Esta última, es considerada el estándar de oro del serodiagnóstico por su insuperable especificidad diagnóstica (serovar/serogrupo) en comparación con las otras pruebas disponibles actualmente (WHO, 2003). Sin embargo, en ocasiones puede mostrar resultados poco concluyentes debido a la dificultad de obtener segundas muestras serológicas del paciente que permitan observar la seroconversión cuando en la primera muestra se presentan resultados negativos o títulos bajos (De Abreu et al., 2006; Levett & Branch, 2002). Por otra parte, también se puede mencionar las restricciones de algunos laboratorios de disponer de un gran número de cepas de referencia de Leptospira spp., útiles para llevar a cabo la prueba.

Actualmente, es muy recomendable contar con métodos de diagnostico de leptospirosis basados en las técnicas moleculares modernas, como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, de sus siglas en inglés) puesto que ha resultado ser muy útil en la detección de diversos patógenos, presentando varias ventajas sobre las técnicas de detección serológicas como mayor sensibilidad y rapidez en la obtención de resultados (Branger et al., 2005; Kurilung et al., 2017; Riediger et al., 2017).

Algunos protocolos de diagnóstico de leptospirosis mediante PCR, se basan en la amplificación el gen LipL32 que codifica a una lipoproteína altamente conservada en la membrana externa de las especies patógenas de leptospiras, además es considerada importante en la patogénesis de la enfermedad (Kumaran et al., 2017; Vivian et al., 2009).

El uso rutinario de la PCR para el diagnóstico de leptospirosis podría ayudar a superar las limitaciones de la MAT mencionadas anteriormente y permitir la detección durante el periodo de días en el que la bacteria se encuentra en sangre (fase septicémica) e inclusive en orina. Muchos de los laboratorios oficiales que diagnostican leptospirosis en México, no cuentan con esta técnica molecular invaluable para el diagnóstico y tratamiento temprano en los casos sospechosos y positivos de leptospirosis.

El objetivo del presente trabajo fue comparar la aplicación de la técnica de PCR y MAT para el diagnóstico de leptospirosis en sueros de pacientes sintomáticos referidos al Laboratorio Estatal de Salud Pública de Sonora (Lespson).

Se establecieron las condiciones experimentales de la técnica de PCR para la amplificación de un fragmento interno del gen LipL32 (260 pb) utilizando 6 cepas de referencia de Leptospira. La Figura 1 muestra el perfil electroforético en gel de agarosa de los productos de PCR de un fragmento interno del gen LipL32 de Leptospira, de los serovares: canicola, icterohemorragica, pyrogenes, automnalis, cynopteri y hardjo respectivamente (260 pb). Los resultados muestran la obtención del amplicón de tamaño esperado, según lo descrito por Branger et al., (2005).

Figura 1 Fuente: Elaboración propia

Se analizaron 34 sueros de pacientes con sospecha de leptospirosis mediante MAT y PCR, de los cuales se detectaron como positivos e indeterminados mediante MAT a 3 (9%) pacientes, mismos que resultaron positivos también por PCR. De los 31 pacientes con resultado negativo o no confirmado mediante MAT encontramos que 7 (20%) de esos pacientes presentaron un resultado positivo a la técnica de PCR (Tabla 1), esto nos indica que la técnica de PCR es más sensible que la de MAT para el diagnóstico de la enfermedad en los primeros días de iniciados los síntomas. La sensibilidad y especificidad de la técnica de PCR fue de 100% y 77.4%, respectivamente. Adicionalmente, se encontró que 2 casos positivos por PCR presentaron coinfección con Dengue (MAT negativo) y Rickettsia (MAT indeterminado) (Tabla 1).

Tabla 1

Caso	MAT	MAT	PCR	PCR	Co-infección
	( + )	( - )	( + )	( - )
Positivo-infección reciente (1 : 1280)	1	-	1	-	0
Positivo-indeterminado (1 : 80 y 1 : 160)	2	-	2	-	1 (Rickettsia)
Negativo o no confirmado	-	31	7/31(20%)	24	1 (Dengue)
Total de pacientes	3/34 (9%)	31/34 (91%)	10/34 (29%)	24/34 (71%)	2
(n = 34)

Fuente: Elaboración propia

En cuanto a los síntomas clínicos más frecuentes referidos por los pacientes confirmados o probables casos de leptospirosis podemos mencionar: fiebre (100%), dolor de cabeza (100%), dolor muscular (100%), artralgia (90%), diarrea o dolor abdominal (50%), entre otros. Un dato relevante que encontramos en este trabajo fue el hecho de encontrar un caso de defunción que presentó escape de líquidos, signo clínico no presente en el resto de los pacientes, que pudo haber agravado el estado de salud del paciente. Cabe mencionar que este caso de defunción tuvo un resultado positivo a leptospirosis mediante PCR y negativo al MAT (Tabla 2).

Tabla 2

	Casos positivos e indeterminados # (n = 3)		Casos probables * (n = 7)		Total de casos (n = 10)
	n	Porcentaje	n	Porcentaje	n	Porcentaje
Signos y síntomas
Fiebre	3	100	7	100	10	100
Dolor de cabeza	3	100	7	100	10	100
Dolor muscular	3	100	7	100	10	100
Artralgia	3	100	6	86	9	90
Diarrea o dolor abdominal	2	66	4	57	6	60
Problemas respiratorios	2	66	3	43	5	50
Otros **	1	33	6	86	7	70
Nausea y vómitos	1	33	5	71	6	60
Dolor retro cular	1	33	5	71	6	60
Fotofobia	1	33	5	71	6	60
Conjuntivitis	1	33	4	57	5	50
Lesiones cutáneas y subcutáneas	1	33	3	43	4	40
Ictericia	1	33	0	0	1	10
Esplenomegalia	1	33	0	0	1	10
Hemorragia	0	0	2	29	2	20
Escape de líquidos ***	0	0	1	14	1	10

# Casos positivos e indeterminados mediante MAT.

La leptospirosis es una enfermedad re-emergente de importancia en salud pública. Sin embargo, no se ha sistematizado y ampliado su vigilancia epidemiológica, y existen factores bioclimáticos que pueden favorecer su presencia en diferentes regiones, por lo que los datos de prevalencia en el país podrían estar subestimados (Sánchez-Montes, Espinoza-Martínez, Ríos-Muñoz, Bersunza-Cruz & Becker, 2015). El éxito del control epidemiológico de la leptospirosis depende de su prevención y diagnóstico oportuno. Algunos trabajos han demostrado que los tratamientos farmacológicos utilizados contra esta enfermedad son más efectivos si se administran en las primeras etapas del padecimiento (Koizumi & Watanabe, 2009). Las limitantes del diagnóstico oportuno son la disponibilidad de métodos directos o indirectos en los laboratorios oficiales. Por ello, en el presente trabajo se utilizó una técnica de PCR capaz de detectar la presencia de la bacteria Leptospira spp., en cultivos de cepas de referencia y en muestras clínicas de humanos. La PCR permitió identificar un mayor porcentaje de muestras positivas (29%) con respecto al estándar de referencia MAT (9%). El aumento en la sensibilidad de diagnóstico de técnicas moleculares con respecto a las pruebas serológicas, también ha sido reportado por otros autores (Mullan & Panwala, 2016; Woods et al., 2017).

Las diferencias encontradas entre las pruebas son atribuibles a la misma evolución natural de la enfermedad, donde la bacteremia se observa en los primeros días de infección, cuando es más factible que sea detectable por pruebas moleculares pero no serológicas; posteriomente baja la carga bacteriana y da paso a la aparición de anticuerpos IgM, base del diagnóstico por MAT. Por lo que es importante realizar más estudios sobre la concordancia y complementariedad de las técnicas cuando se tiene solo una muestra, para tener un tratamiento más oportuno de los pacientes (Waggoner et al., 2015).

La co-infección observada de los pacientes PCR positivos con Dengue y Rickettsia, respectivamente, también ha sido observada en estudios previos (Levett, Branch & Edwards, 2000; Navarrete-Espinosa et al., 2015). La mayoría de los pacientes refieren una sintomatología clínica muy característica de la enfermedad y además presentan una similitud entre ellos en algunas manifestaciones, características observadas en otros trabajos (Ooteman et al., 2006).

Cabe mencionar que el periodo de septicemia puede llegar a durar hasta diez días después de contraída la infección, esta situación pone en mayor vulnerabilidad a personas con problemas previos de salud (por ejemplo, riñón, hígado y pulmón) pudiendo evolucionar de una manera más agresiva e incluso provocar la muerte, como pudo haber sido el caso del paciente fallecido.

En el presente trabajo se demostró la utilidad y beneficios que tiene la prueba de laboratorio PCR como complemento al MAT para el diagnóstico de leptospirosis sobre todo en los primeros días de la enfermedad y en aquellos pacientes donde se carece de muestras pareadas. Implementarla de forma rutinaria permitiría un diagnóstico más oportuno y preciso en la evolución de la enfermedad y lograría reducir el índice de casos indeterminados y falsos negativos que se presentan en muchos de los casos donde solo se realiza el MAT, situación de suma importancia desde el punto de vista de salud pública.