Renacuajos de rana toro Lithobates catesbeianus fueron expuestosbajo condiciones de laboratorio a cinco concentraciones de cloruro de cadmio(0.05 mg/L, 0.10 mg/L, 0.125 mg/L, 0.15 mg/L y 0.175 mg/L), para examinar losefectos en el tejido hepático y determinar la concentración letal mediaCL50) durante el desarrollo larval. Se utilizaron 60 renacuajospor ensayo entre los estadios 21-25 de Gosner; se colocaron 10 individuos porrecipiente en dos litros de agua a diferentes concentraciones del metal durante96 horas. Una vez terminados los ensayos, se extrajeron los hígados de losorganismos para realizar un análisis histológico convencional. La concentracióncorrespondiente al 50% de mortalidad de las larvas obtenidas mediante elsoftware EPA Probit fue de 0.115 mg/L. El análisis histológico mostró mayordeterioro en la estructura celular hepática a medida que fueron aumentando lasconcentraciones del metal. Por lo tanto, se determinó que estos organismos sonsensibles a bajas concentraciones de cloruro de cadmio.

Los anfibios son organismos que se caracterizan por mantener una gran dependencia delagua, un ciclo de vida complejo y por poseer una sensibilidad fisiológica ante lascondiciones ambientales (Duellman & Trueb,1994). Tienen un tegumento altamente permeable, cuya estructura además deprotegerlo resulta fundamental para el intercambio gaseoso. El desarrolloembrionario es dependiente del agua, por lo que los estadios larvales y embrionariosestán particularmente expuestos a contaminantes y juegan un papel significante enlos programas de biomonitoreo (Gürkan, Çetin &Hayretdaĝ, 2014). Se considera que los anfibios son buenos bioindicadoresde contaminación ambiental debido a su susceptibilidad a la contaminación ambientaldurante sus ciclos de desarrollo en el agua. Por esta razón, son usados en estudiosde toxicología acuática (Venturino etal., 2003). Lo anterior hace de especial interés su estudioen el marco de una investigación ecotoxicológica, ya que permite evaluar ambientesacuáticos que funcionan como cuerpos receptores de contaminación, siendo losanfibios uno de los grupos biológicos más afectados por las alteraciones de suentorno ecológico (Agostini, 2013; Sparling, Bishop & Linder, 2000; Wells, 2007).

Existe una creciente preocupación sobre la disminución mundial en las poblaciones deanfibios (Grillitsch & Chovanec, 1994; Rowe,Hopkins & Bridges, 2003). Dicha disminución es atribuida, entre otrosfactores, a la enorme cantidad de desechos producto de actividades antropogénicas,que son descargados en los cuerpos de agua. Un declive en las poblaciones deanfibios debido a la contaminación no solo conduce a una disminución en labiodiversidad, sino que puede llegar a tener impactos en la estructura trófica dealgunos hábitats (Home & Dunson, 1994;Venturino et al.,2003).

Los estudios en donde los anfibios han sido utilizados como bioindicadores decontaminación en la etapa pre metamórfica, incluyen análisis del daño celular ytisular en diversos órganos (Seixas etal., 2017), retraso en el crecimiento, teratomas yregeneración de extremidades (Khangarot & Ray,1987; Nebeker, Schuytem & Ott,1994), daño genético (Campana, Panzeri,Moreno & Dulout, 2003; Machado daRocha et al., 2012), efecto en el desarrollo ocasionadopor metales pesados (Khangarot & Ray,1987; Rowe et al.,2003) entre otros, los que han servido para evaluar la presencia y losefectos de algunos compuestos considerados como agentes externos potencialmentecontaminantes.

Los metales pesados son algunos de los principales contaminantes que reciben losdepósitos naturales de agua en general, los cuales han demostrado ser peligrosospara los organismos acuáticos por su persistencia y toxicidad, ya que puedenincorporarse a la cadena alimenticia y ser bioconcentrados por los organismos (Burger & Nodgrass, 1998; Taiwo, Henry & Imbufe, 2014). Entre ellos,el cadmio (Cd) ha sido detectado en más de 1000 especies de flora y fauna, tantoacuática como terrestre (United States Environmental Protection AgengyOffice of Water[USEPA], 2001;1999). El cadmio está presente en lanaturaleza en distintos tipos de rocas, sedimentos marinos y en el agua de mar,producto del aporte de fenómenos como las erupciones volcánicas y los incendiosforestales (Group of Experts on the Scientific Aspects ofPollution[GESAMP], 1985).Considerado el más móvil de los contaminantes metálicos del ambiente acuático, estambién bioacumulable y persistente, con tiempos de vida media estimados entre 10 y30 años (Greenpeace, 2000).

Los anfibios presentan una gran variedad de respuestas subletales como cambios encrecimiento, rangos de desarrollo, pigmentación y deformidades morfológicas en unmenor tiempo de exposición a contaminantes ambientales (Khangarot & Ray, 1987), siendo residentes de sistemasacuáticos y por poseer la característica ya mencionada de piel semipermeable, sonparticularmente susceptibles a la contaminación por metales pesados (Taiwo et al., 2014). Auncuando se han realizado diversos estudios ambientales y ecotoxicológicos con la ranatoro, existen pocos trabajos de exposición a metales en las primeras fases de sudesarrollo embrionario y larvario. El presente trabajo consistió en exponerrenacuajos de rana toro Lithobates catesbeianus (Shaw, 1802) encondiciones controladas a distintas concentraciones de CdCl2 para evaluarsu efecto en función de la mortalidad y analizar el daño en el tejido hepáticomediante técnica histológica convencional.

Se utilizaron renacuajos de Lithobates catesbeianus de 3 cm a 5cm de longitud que, de acuerdo a Gosner(1960), corresponden a los estadios 21 a 25, considerados como etapasen las cuales los principales órganos del metabolismo larval ya se encuentrandesarrollados. Los renacuajos fueron adquiridos de la Unidad de Manejo de parala conservación de la vida Silvestre (UMA) Aquanimals, S.A. de C.V. (Secretaríade Medio Ambiente y Recursos Naturales [Semarnat]-UMA-IN-00037-QRO). Antes delexperimento, los ejemplares se aclimataron durante una semana. Durante esteperiodo los organismos se mantuvieron en condiciones estándar de temperatura (25°C a 28 ºC), fotoperiodo de 12 h luz y 12 h oscuridad, aireación constante,alimentación ad libitum una vez al día, pero en horariosvariables con alimento balanceado comercial para peces como bagre y trucha.

Para determinar las concentraciones a utilizar en la obtención de laCL50, se realizaron dos bioensayos preliminares, los quepermitieron definir de una manera más precisa los rangos de concentración delCloruro de Cadmio (CdCl2), expresado en mg/L. Se asignaron 4renacuajos del mismo tamaño (3 cm a 5 cm) por pecera de manera aleatoria. Secolocaron las peceras de plástico con aireación independiente y se adicionó elCdCl2 (Merck) anhidro, a partir de una solución “stock” preparadacon agua destilada. Las concentraciones probadas fueron para el primer bioensayopreliminar: 0.5 mg/L, 1.0 mg/L, 2.0 mg/L, 3.0 mg/L y 4.0 mg/L y 0.0125 mg/L,0.025 mg/L, 0.05 mg/L, 0.10 mg/L y 0.20 mg/L para el segundo.

Para la obtención de la CL50 se realizaron dos bioensayos. Para elprimer bioensayo se utilizaron las siguientes concentraciones deCdCl2: 0.10 mg/L, 0.15 mg/L, 0.175 mg/L, 0.20 mg/L y 0.25 mg/L,mientras que para el segundo bioensayo fueron: 0.05 mg/L, 0.10 mg/L, 0.125 mg/L,0.15 mg/L y 0.175 mg/L. En ambos casos, se colocó un grupo sin tratamiento comocontrol negativo. La longitud de los organismos fue de 3 cm a 5 cm (estadios 21a 25 de Gosner, 1960). El sistemabiológico consistente en recipientes de plástico (15 cm × 20 cm × 15 cm),conteniendo 2 L de agua purificada de laboratorio, suplementado con aireaciónconstante, temperatura controlada (25 ºC a 26 ºC.) y alimentación “adlibitum”. Se utilizaron 120 ejemplares, a razón de 10 renacuajospor recipiente, distribuidos de la siguiente manera: un grupo control sintratamiento y cinco contenedores con las siguientes concentraciones deCdCl2: 0.10 mg/L, 0.15 mg/L, 0.175 mg/L, 0.20 mg/L y 0.25 mg/Lpara el primer bioensayo y: 0.05 mg/L, 0.10 mg/L, 0.125 mg/L, 0.15 mg/L y 0.175mg/L para el segundo. Para la preparación de las distintas concentraciones separtió de una solución stock de 1000 mg de CdCl2 /L en agua.

Una vez iniciado el experimento se hicieron observaciones durante 96 horas, conel fin de evaluar la mortalidad de los renacuajos y calcular la CL50.Durante el experimento se registró la hora de muerte de los organismos einformación correspondiente a las concentraciones. Para evaluación de lamortalidad y el cálculo de la CL50, los renacuajos fueronmonitoreados durante 96 horas, registrando la cantidad y la hora de muerte delos individuos e información correspondiente a las concentraciones. Se realizóla disección, obtención de tejido hepático y fijación en una solución de formolal 10% con buffer de fosfatos, para su posterior análisis mediante técnicahistológica convencional.

Al finalizar el tiempo de exposición, la obtención del hígado de los renacuajosse realizó con ayuda de un microscopio estereoscópico, navajas y pinzas de puntafina. Se obtuvieron muestras de tejido hepático de 5 mm de grosor, sedeshidrataron en alcoholes graduales y se incluyeron en parafina utilizando unhistoquinette Leica TP1020. Los cortes de 3 µm se realizaron con un micrótomorotatorio Leica Modelo. Fueron teñidos con hematoxilina y eosina (HE) y semontaron con bálsamo de Canadá. Los cortes fueron observados en un microscopioinvertido Nikon Eclipse Modelo TE 2000-U.

Los resultados se obtuvieron con el promedio de los bioensayos efectuados porduplicado y la determinación de la CL50 se llevó a cabo utilizando elsoftware Enviromental Protection Agency Probit (versión1.5).

Los resultados obtenidos en el primer bioensayo (Figura 1) evidenciaron que con 1.0 mg/L de CdCl2 a las 12h de exposición, solamente sobrevivió el 50% de los renacuajos de L.catesbeianus, y con 2.0 mg/L del reactivo a las 15 h murió el 100%de organismos expuestos. Las concentraciones con sobrevivencia en tiempo menor alas 24 h no están descritas en el gráfico debido a que resultaron muy tóxicaspara los organismos en estas condiciones. En el segundo bioensayo los renacuajosexpuestos a concentraciones entre 0.0125 mg/L a 0.025 mg/L sobrevivieron más de24 h, mientras que aquellos expuestos a 0.10 mg/L a 0.20 mg/L sobrevivieron másde 24 h solo el 50%. Las concentraciones donde se obtuvieron sobrevivencias del50% durante 24 h las siguientes: 0.05 mg/L, 0.10 mg/L, y 0.20 mg/L. Por loanterior se determinó usar un rango de concentraciones entre 0.05 mg/L a 0.25mg/L de CdCl2 para el cálculo de la concentración letal media(CL50).

En las concentraciones correspondientes a 0.20 mg/L y 0.25 mg/L se observarondificultades de nado en algunas de las larvas a las ocho horas de exposición,mientras que en las concentraciones de 0.175 mg/L y 0.15 mg/L a las cinco horasde exposición todos los organismos se encontraban en un estado de reposo.

Al concluir los ensayos efectuados para obtener la CL50, solosobrevivieron los organismos expuestos a concentraciones de 0.05 mg/L - 0.175mg/L (Figura 1) y posteriormente murieronlas larvas sobrevivientes de las concentraciones de 0.10 mg/L a 0.175 mg/L enlas 72 h siguientes. Los organismos expuestos a 0.05 mg/L sobrevivieron un mesmás, estos organismos presentaron daños en la piel, como fueron manchas negras odesprendimiento de esta. Por otro lado, no se observó algún cambio en sumovilidad o alimentación.

En la Figura 2 se muestran los porcentajesde mortalidad obtenidos con las diferentes concentraciones de CdCl2para el primer y segundo ensayos respectivamente y un tiempo de exposición de 96h, así como la concentración letal obtenida en cada uno de ellos. La líneapunteada muestra gráficamente la CL50 obtenida mediante el programaEPA Probit. Como cabría esperar, la relación dosis-respuesta se ajusta bien auna forma sigmoidea en todas las concentraciones estudiadas.

Finalmente, los datos obtenidos de CL50 en ambos bioensayos sepromediaron, obteniendo una CL50 para las larvas deLithobates catesbeianus de 0.115 mg/L deCdCl2.

Al finalizar el tiempo de exposición, se analizaron tres muestras histológicas detejido hepático por cada una de las concentraciones de CdCl2probadas. Los cortes histológicos de hígado mostraron alteraciones morfológicasen los hepatocitos, modificando su tamaño y arreglo tisular, así comoalteraciones en el núcleo celular, evidenciadas por la disminución de su forma ytamaño de manera considerable, estos cambios fueron directamente proporcionalesdel aumento de las concentraciones de CdCl2 (Figura 3a-3f). Estos cambios se observaron en todas lasmuestras a partir de la concentración más baja (0.05 mg/L), tales como lacontracción del núcleo celular y condensación de la cromatina, efecto conocidocomo picnosis nuclear, este efecto está relacionado con el proceso de muertecelular. Con la concentración de 0.10 mg/L se visualizaron células picnóticascariorrexicas, en estas últimas se observa el núcleo fragmentado. Ya que despuésde pasar por la picnosis, el núcleo celular estalla y posteriormente se presentala necrosis celular. En concentraciones de 0.125 mg/L se comenzó a observar lamuerte del tejido caracterizada por cambios en la membrana celular, alteracionesmorfológicas y picnosis y en concentraciones mayores a 0.15 mg/L, la necrosiscelular estaba presente en la mayor parte del tejido hepático (Figura 3e-3f).

En ensayos de exposición aguda realizados por distintos investigadores, se hademostrado el efecto de algunos metales pesados en larvas de anfibios, sin embargo,se han reportado resultados distintos en cuanto a la susceptibilidad de losorganismos dependiendo de los tiempos y concentraciones de exposición. En un estudiosimilar Woodall, Maclean & Crossley(1988), reportaron un valor de CL50 en renacuajos deXenopus laevis expuestos a CdCl2, durante 96 h de79.90 mg/L mientras que Slooff & Baerselman(1980) reportaron una CL50 de 31.96 mg/L en la misma especieexpuesta a Cd (NO3)2 durante 48 h. Mientras que Leuven, Den Hartog, Christiaans & Heijligers(1986) reportaron que hasta 0.004 mg/L de Cd no tienen efecto sobre losembriones de la especie Rana temporaria, pero la misma cantidad estóxica para las larvas. Lo anterior se puede relacionar con la fuente de alimento delos embriones proveniente del saco vitelino, mientras que las larvas filtran y tomanel alimento del entorno ambiental y pueden bioacumular los contaminantes y tenerexposiciones sucesivas en un ambiente acuático. En un estudio conducido por Lefcorty su equipo en 1998, usando Rana luteiventris, se comprobaronefectos sobre la sobrevivencia, metamorfosis y comportamiento frente a predadores demetales pesados, entre ellos cadmio, aún a concentraciones bajas (Lefcort et al., 1998). Ennuestro trabajo, el valor obtenido a 96 h de la CL50 de CdCl2en renacuajos de Lithobates catesbeianus en las etapas 22 y 25 deGosner fue de 0.115 mg/L, lo que demuestra que esta especie no es capaz de soportaraltas concentraciones de cadmio durante largo tiempo, ya que se presentaron tasas demortalidad elevadas y a tiempos menores se observaron cambios en la conducta(alimentación, inactividad) durante las primeras horas de exposición al metal. Enespecies acuáticas se han observado diferencias en cuanto a las respuestasbiológicas a un mismo contaminante (Cerino,1992), esto puede ser atribuible al metabolismo basal y fisiología decada organismo, así como a la biodisponibilidad y variabilidad biológicainterespecífica. Estudios con Euphlyctis hexadactylus de la India,sugieren que el cadmio puede tener efectos tóxicos sobre el sistema inmune de losanfibios Priyadarshani, Madhushani, Jayawardena,Wickramasinghe & Udagama (2015).

Los renacuajos de Lithobates catesbeianus fueron sensibles a lasbajas concentraciones que se manejaron en nuestro ensayo, ya que si se compara conla resistencia que presentan organismos acuáticos pertenecientes a otros géneroshacia el cadmio; por ejemplo, estudios realizados con alevines del hibrido Cachamoto(Colossoma macropomum x Piaractus brachypomus) se obtuvo unaCL50 de acetato de cadmio de 22.96 mg/L en 96 h de exposición (Vásquez, Bastardo & Mundarain, 2005).

Los daños observados a nivel hepático podrían relacionarse con la acumulación decadmio en los hepatocitos, ya que, de acuerdo con Legorburu, Canton, Millan, Casado & Álvarez, (1988), anteexposiciones agudas y crónicas, el hígado puede bioacumular Cadmio, Hierro y Cobre.Dichos procesos de bioacumulación de metales en los seres vivos son complejos ydependen de varios factores, uno de ellos está relacionado con la etapa deldesarrollo embrionario o del ciclo de vida en la que se encuentren. Vogiatzis & Loumbourdi (1998), observaronun efecto acumulativo de este metal en hígado y riñón, con una correlación positiva,a mayores tiempos de exposición, probando distintas concentraciones deCdCl2 en larvas de la especie Rana ridibunda. Aunquees muy limitada la información sobre la toxicidad y efectos de metales pesados en eltejido de los anfibios, los resultados obtenidos hasta ahora sugieren que la ranatoro Lithobates catesbeianus puede ser altamente susceptible asustancias extrañas cuando están presentes en su ambiente (Sima-Álvarez, 2001), debido a que los renacuajos utilizan lapiel como parte importante para su respiración (Duellman & Trueb, 1986; Meglitsch, 1967; Villee, 1992). Las determinaciones, realizadas sugieren que lanecrosis en el hígado observada en las concentraciones más altas deCdCl2, corresponden a una relación concentración-efecto.

La concentración letal media (CL50) en larvas de Lithobatescatesbeianus en ensayo de exposición aguda a CdCl2 durante96 horas la cual fue de 0.115 mg/L.

Las concentraciones correspondientes a 0.20 mg/L y 0.25 mg/L a ocho horas deexposición y las de 0.175 mg/L y 0.15 mg/L a las cinco horas de exposición tuvieronefectos sobre el comportamiento de nado.

La concentración de 0.05 mg/L de CdCl2 provocó efectos adversos a nivelhepático en las larvas de Lithobates catesbeianus. En lascondiciones del presente estudio, concentraciones muy bajas de CdCl2provocan daños a nivel tisular en el hígado de los organismos expuestos alcontaminante, dichos daños son dependientes de la concentración y el tiempo deexposición.

El presente estudio sugiere que las larvas de Lithobatescatesbeianus son altamente sensibles ante exposiciones agudas deCdCl2, por lo que es factible y práctica su utilización como modeloen estudios ecotoxicológicos, tomando en cuenta que es una especie consideradainvasiva y de relativa fácil adquisición; con esto se evitaría afectar a lasespecies de anfibios endémicas, que se encuentran amenazadas o en peligro deextinción.